液滴测序（Drop-seq）是一种基于使用微流体技术快速分析数千个单细胞的方法，其由哈佛医学院Steven McCarroll领导的团队开发。Drop-seq测序成本更低，速度更快（每天可以分析约1万个细胞），该测序方法可以用来表征具有许多细胞类型和状态的复杂组织。
测序原理
Drop-seq利用微流控装置将带有条形码的微珠和细胞一起装入微液滴。微液滴将细胞分割成纳升大小的反应室，条形码随后会连接到反转录后的cDNA上，由此检测数以千计的细胞。
Drop-seq可以使用两种类型的珠子
A：“简单”微粒
B：水凝胶微粒
使用“简单”微粒的Drop-seq流程
1.细胞分离：从复杂组织中制备单细胞悬浮液。
2.引物（primer）合成：每个微粒（beads）上含有超过108个独立的引物，其引物序列包含四个部分：PCR primer、12bp的细胞条形码（Cell Barcode）、8bp的分子标识符（UMI）和30bp的Poly(dT)序列。
- “PCR primer”在所有引物和beads具有相同的恒定序列，以保证在STAMP形成后进行PCR扩增。
- “Cell Barcode”：在相同微粒的所有引物上相同，但与其他beads上的Cell Barcode不同。将微粒库分成四个大小相等的寡核苷酸合成反应，分别向其中加入四种DNA碱基中的一种（A、G、C、T），总共进行12次分裂-池-循环（split-pool-cycles），每个循环后将微粒合并在一起，每个微粒共有412（16,777,216）种可能的碱基序列。
- UMI：可鉴定PCR duplications。在split-pool-cycles完成后，所有微粒进行八轮简并合成反应，每个循环可用四种DNA碱基（A、G、C、T），每个单独的引物（UMI）共有48（65,536）种可能的序列。
- Poly(dT)序列，用于捕获mRNA，启动逆转录。
3.微流体装置：使用微流体装置，将制备好的细胞悬液与beads一起包裹在一个微小的液滴中。该装置包括两路水相，一路流相包含细胞。另一路流相包含悬浮在裂解缓冲液中的beads。
- 细胞：4000μl/hr～66.7μl/min
- Beads：4000μl/hr～66.7μl/min
- 油：15000μl/h～250μl/min
4.细胞裂解和RNA杂交：在液滴形成后，裂解细胞并释放其mRNA。随后mRNA与beads上的poly dT引物相接触，并进行杂交。
5.STAMP一代：通过添加试剂使液滴油-水界面不稳定，并收集和洗涤微粒，然后将mRNA逆转录成cDNA，形成一组称为“附着于微粒的单细胞转录组（STAMPs）”的beads。
6.STAMP的放大：通过PCR反应在池（pools）中扩增条形码化的STAMP，用于高通量测序。
7.测序和分析：使用高容量平行测序对每个末端对得到的分子进行测序。使用STAMP条形码推断每个转录物的起源细胞。通过UMI对每个细胞中确定的每个基因的mRNA转录物的数量进行重复序列读数。随后，可以建立数字基因表达测量矩阵（每个细胞每个基因一个测量）用于进一步的分析。
使用水凝胶微珠与使用“简单”微粒的操作原理及测序流程大致相同，但在以下两个方面不同：
- 水凝胶微珠的引物位于beads内，而不是位于beads的表面上。
- 微流体装置由三个通道组成，而不是两个通道组成
- 一个通道包含悬浮在裂解缓冲液中的beads。
- 一个通道包含细胞。
- 另一路通道包含需要进行分析的化学试剂。
优点
- 很短的时间内有很高的吞吐量。
- 成本较低，减少昂贵药品的消耗。
缺点
- 细胞捕获率较低，适合样本丰富的研究，不太适合用于少量样本和珍贵样本的检测。