自20世纪70年代中期融合标签技术出现以来,亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具,具有结合特性高、纯化条件温和、纯化步骤简单、适用性广泛等显著优势。目前为止已出现了种类众多,功能各异、用途多样的亲和标签,极大的促进了重组蛋白的有效纯化。

常用亲和标签列表

类型 大小(KDa) 残基数 序列
Flag-tag 1.01 8 DYKDDDDK
6*His-tag 0.84 2~10(通常6个 HHHHHH
HA-tag 1.10 9 YPYDVPDYA
GST-tag 26.00 211 蛋白质
c-myc-tag 1.20 10 EQKLISEEDL
SPA-tag 12.00~13.00 116 蛋白质
S-tag 1.75 15 KETAAAKFERQHMDS
Arg-tag 0.80 5~6(通常5个) RRRRR
Strep-tag Ⅱ 1 8 WSHPQFEK
CBP 4 26 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL

亲和标签分类

根据自身分子量大小的不同可分为两类:① 一类为大的蛋白质分子如GST-tag、SPA-tag、GFP-tag等。使用时会增加目标蛋白的溶解性,但在蛋白结晶和抗体生产的过程中,标签必须去除。

②另一类为小的多肽标签如6*His-tag、HA-tag、c-myc tag等。多数情况下由于多肽标签相对较小,对融合蛋白质结构影响小,不需要从融合蛋白质中切除,因而多肽标签较蛋白质标签更为常用。

常用亲和标签

Flag-tag

Flag标签是由八个亲水氨基酸(DYKDDDDK)组成的一个短肽,分子量很小,因此不会遮盖融合蛋白中其他蛋白表位与结构域。该标签具有天然的亲水特性,可位于蛋白质的C端或N端,利于抗体检测,同时含有一个肠激酶切割位点,可通过肠激酶切除标签。

His-tag

His-tag由人工合成的组氨酸首尾相连构成,通常由6个氨基酸(HHHHHH)组成,也有3个和8个的情况。His融合标签与其他标签相比有很多明显优势,是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。His标签融合蛋白一般采用固定化金属离子亲和层析进行分离纯化,操作较为简便。

StrepⅡ-tag

StrepⅡ即链霉亲和素结合肽,是一个小分子的短肽标签,由8个氨基酸(WSHPQFEK)组成,可位于融合蛋白的任一位置。广泛应用于多种目标蛋白在原核表达系统、哺乳动物表达系统等的纯化。

GST-tag

GST即谷胱甘肽-S-转移酶,具有解毒作用,可将谷胱甘肽中的硫基转移至含硝基或卤化物的复合物中。其天然大小为26KD。近年来,商品化的GST融合蛋白表达体系以及GST标签抗体系统至今仍被广泛应用。近年来在原核表达体系中,谷胱甘肽S转移酶GST表达纯化系统的应用更为普遍。

HA-tag

HA标签蛋白,标签序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇,9个氨基酸,对外源靶蛋白的空间结构影响小,容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti-HA抗体检测和ELISA检测。

C-myc-tag

c-myc 标签蛋白,是含11个氨基酸的小标签,标签序列Glu- Gln-Lys-Leu-lle-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,这11个氨基酸作为抗原表位,表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。 C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中,可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

MBP-tag

MBP-tag(麦芽糖结合蛋白)是由大肠杆菌K12的maLE基因编码的396个氨基酸组成,大小为40KDa,同GST标签一样,MBP标签能增大融合蛋白可溶性,提高其表达产量。

eGFP-tag

eGFP标签蛋白,是增强型绿色荧光蛋白。eGFP激发波长为488m,发射波长为507nm,是由野生型绿色荧光蛋白GFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。相对于GFP,eGFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的KOza K序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

Avi-tag

Avi-tag是由15个氨基酸组成的短肽,具有一个单生物素化赖氨酸位点,与已知天然可生物素化序列完全不同。Avi-tag加在目标蛋白的N端和C端融合表达后,可被生物素连接酶生物素化,可用于蛋白质分离纯化及蛋白质相互作用研究。

Profinity eXact tag

Profinity eXact标签是由野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN’的功能前域,经基因改造而得到的大小约为8.2kDa的一段多肽。利用基因工程的方法对该功能域进行改造,提高其稳定性,使其含有一段枯草杆菌蛋白酶突变体S189的剪切识别序列(EEDKLFKAL)。由此发展的Profinity eXact亲和纯化技术越来越多的应用于重组蛋白的分离纯化实验中。

IMPACT System

内含肽(inteins)是前体蛋白中自然发生的一段蛋白序列,能够在翻译后自我催化蛋白质的剪接,使得自身从前体蛋白中切除。根据内含肽自我剪接的特性,将常规的亲和标签与自我剪切的内含肽有机结合,形成了新颖的自我剪切亲和标签。在实验时能同时达到蛋白纯化与标签去除的双重目的,不仅具有了亲和纯化的高度特异性,并且免去了去除标签的繁琐步骤,目前已成功用于多种重组蛋白的分离纯化中。

PHB System

PHB,即聚羟基丁酯,是一种由多种微生物产生的可生物降解的聚合物。研究发现,小分子蛋白phasins对PHB颗粒有很强的特异性亲和力,因此将phasins作为亲和标签,构建“phasins-内含肽-目标蛋白”的融合蛋白,与PHB颗粒一起在含有两个质粒的表达宿主中共表达,最终也可回收到较高纯度的无标签目的蛋白。

ELP System

ELP,即弹性蛋白样多肽,一般由5个氨基酸VPGXG组成的基序多次重复构成,其中X可以是除了脯氨酸之外的任一氨基酸。ELP由于其独特的热诱导相变性质,可将ELP作为纯化标签,构建形式为“ELP-内含肽-目标蛋白”的融合标签并在大肠杆菌中大量表达,最终能得到较高纯度且无标签的水溶性目标蛋白。

亲和标签的组合使用

His6-MBP组合标签

His6-MBP组合标签是目前普遍常用的一种亲和标签组合方式。在此组合中,融合蛋白的形式为“His6-MBP-目标蛋白”,其中His标签用于融合蛋白的亲和纯化,MBP部分能够增大目标蛋白的可溶性,提高蛋白产量,His6-MBP与目的蛋白之间加入一段烟草蚀纹病毒蛋白酶切位点,便于后续的标签去除。

串联亲和纯化

该技术方法主要研究蛋白质之间的相互作用。通过在目标蛋白的一端嵌入一个特殊的蛋白标签(如TAP标签),不破坏目标蛋白的调控序列,经过连续两步的亲和层析获得接近自然生理条件下的特定蛋白质复合体,然后用质谱技术鉴定蛋白质。该技术既吸收了亲和纯化得到高纯度低拷贝数的蛋白质复合体,也继承了免疫共沉淀中运用特异性的标记蛋白与亲和层析柱之间的相互作用,可快速得到获得生理条件下与目的蛋白存在真实作用的蛋白质。

亲和标签的作用

①蛋白质的纯化

融合标签技术已广泛用于重组蛋白质的纯化。通过融合蛋白中携带的标签,产物仅需一步亲和层析就可获得有效的纯化,纯化后产物进一步利用化学方法或特异性的蛋白酶切割,即可得到纯度高、质量好的目的蛋白。目前较常用的蛋白纯化标签有FLAG,GST和His标签,不仅仅这些标签本身可用于蛋白的纯化,其相对应的单抗或多抗也被应用于融合蛋白的纯化。

②蛋白质的固定与检测

阐明蛋白质之间相互作用,描绘出蛋白质相互作用网络图谱是蛋白质组学研究的重要内容。进入到后蛋白质组学时代后,对蛋白质的研究也相应变的更加细化。生物芯片技术是一种很成熟的技术平台,用以研究蛋白质之间相互作用。其主要原理就是将某些生物分子,如蛋白质或核酸等,固定在固相基质上,利用标签蛋白与配基间的特异性吸附作用很好的将蛋白固定在固相载体表面。这些标签蛋白起到了一种间隔臂的作用,大大降低目的蛋白与固相基质直接接触的几率。与此同时,位于融合蛋白质N端或C端的融合标签,将目标蛋白的活性中心充分暴露,可形成均质配基表面,其对于生物芯片以及基于表面等离子体共振原理的 BLAcore系统发挥作用非常关键。

③提高蛋白产量及增加可溶性

对于宿主菌来说,外源蛋白质具有异质性。故这些外源蛋白在宿主菌内进行表达时,宿主菌会通过各种机制来阻止其过量表达,可导致我们所需要的目的蛋白表达量降低。近几年的研究发现,融合标签的加入可有效的解决这种问题,使重组蛋白的产量增加。

外源蛋白质在宿主菌内表达时大多以包涵体的形式存在,使天然蛋白质的活性大大降低。研究发现一些高度可溶的蛋白质(如MBP等标签蛋白)在与其它蛋白融合后会促进融合蛋白质以可溶形式表达。如SET-tag,其可增强融合蛋白的可溶性表达,该标签以静电排斥来防止新生多肽相互聚集。