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病毒感染宿主细胞是指病毒通过多种途径侵入机体,并依靠宿主细胞的代谢系统来复制、合成自身的核酸、结构蛋白等,然后不断繁殖的过程。

  • 冠状病毒基因组大小为27-32kb,通常包含6-11个开放阅读框(ORF)。冠状病毒的基因顺序一致,为5′-复制酶-S-E-M-N-3’,同时基因组中散布着许多小的ORF,可编码一些辅助蛋白。值得注意的是:冠状病毒复制酶由占据基因组约三分之二的两个大的重叠的ORF(ORF1a和ORF1b)编码,并直接从基因组RNA翻译而来。而结构性蛋白和辅助性蛋白则是从基因组转录/复制过程中产生的亚基因组RNA(subgenomic RNAs,sgRNA)进行翻译而来的。

冠状病毒感染宿主细胞的过程

冠状病毒感染宿主细胞的过程主要有以下几个步骤:

1. 附着和进入宿主细胞

位于病毒颗粒最外层的S蛋白能够和宿主细胞上的相应受体结合进入细胞。S蛋白由两个功能亚基组成:S1(负责识别/结合受体)和S2(负责膜融合),S蛋白决定了冠状病毒的宿主偏好性,一些HCoV采用细胞表面酶作为受体。例如:SARS-CoV通过受体蛋白——血管紧张素转换酶2(Angiotensin Converting Enzyme,ACE2)进入细胞,MERS-CoV通过受体蛋白——二肽基肽酶4(Dipeptidyl Peptidase,DPP4)进入细胞。中科院武汉病毒研究所石正丽团队研究发现,SARS-CoV-2可以类似于SARS-CoV,通过ACE2受体蛋白进入人体[1]。

  • ACE2具有蛋白酶活性,可以切割和激活S蛋白,进而引导病毒和细胞膜融合,帮助病毒进入细胞。

冠状病毒S1亚基(RBD区域)与ACE2受体蛋白的相应部位特异结合后,S1将会进行一系列的构象变化,然后S1解离,在宿主蛋白酶的作用下,会诱发S蛋白构象发生改变,暴露出膜融合肽(FP),S2亚基通过将FP插入宿主细胞膜而改变构象,两个七肽重复区(HR-N和HR-C)形成六螺旋束,将病毒包膜与细胞膜之间的距离拉近,最终导致病毒包膜和细胞膜融合。

  • 冠状病毒可通过内吞途径和非内吞途径进入宿主细胞。低pH条件和依赖pH的组织蛋白酶(cathepsin)可促进病毒的内吞。通常冠状病毒S蛋白会被宿主的蛋白酶激活并进一步切割为S1和S2亚基,S1/S2的切割是由一种或多种宿主的蛋白酶介导的。例如SARS-CoV的S蛋白的激活需要通过内体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶L和另一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶进行序列切割(sequential cleavage)。而MERS-CoV的S蛋白中包含两个弗林蛋白酶(furin)切割位点。宿主因素也可能限制HCoV的附着和进入。例如,干扰素诱导的跨膜蛋白(IFITM)对多种RNA病毒表现出广谱的抗病毒功能。

2. 复制酶的翻译和复制转录复合体的组装

冠状病毒在细胞内分解,将核衣壳和病毒遗传物质RNA释放到细胞质中,以该RNA为转录本,将ORF1a/b翻译成复制酶多聚体蛋白1a(pp1a)和pp1ab,pp1a和pp1ab被病毒蛋白酶PLpro和3CLpro裂解,产生15-16种具有各种功能的非结构蛋白nsp(nsp1-16)。包括RNA聚合酶(RdRP)、木瓜蛋白酶样蛋白酶PLpro和主要蛋白酶Mpro活性和解旋酶在内的病毒聚合酶和蛋白酶,其中nsp12具有RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase,RdRP)活性,nsp3具有木瓜蛋白酶样蛋白酶PLpro(负责切割nsp1/2,nsp2/3和nsp3/4边界)活性,nsp5具有3CL水解酶Mpro活性,而nsp3、4和6还诱导细胞膜重拍,形成双膜囊泡或小泡结构(spherules),而这也正是冠状病毒复制-转录复物(RTC)组装和锚定位点。

除RNA二级结构外,程序性核糖体移码(PRF,programmed ribosomal frameshifting)可能还受病毒或宿主因素的调控。

3. 基因复制和转录

在冠状病毒复制-转录复合物RTC中,在复制酶的作用下,病毒基因组通过其独特的不连续性转录机制,以病毒基因组正链RNA为模板,生成全长的负链RNA;而以负链RNA为模板,又可合成新的基因组RNA。聚合酶还可在基因组的特定位点(转录调节序列)的不连续转录过程中切换模板,从而产生5’嵌套的反义亚基因组sgRNA,并以其为模板合成3’嵌套的正义sgRNA(mRNAs)。

4. 结构性蛋白的翻译

亚基因组mRNAs翻译,产生S、M、N和E等结构蛋白和辅助蛋白。大多数冠状病毒sgRNA是单顺反子,因此只有5′-最末端的ORF以帽依赖的方式翻译。但是,某些sgRNA也可以采用其他机制,例如核糖体渗漏扫描(ribosome leaky scanning)和核糖体内部进入(ribosome internal entry),来翻译其他ORF。跨膜结构蛋白(S,HE,M和E)和一些与膜相关的辅助蛋白在内质网ER中翻译,而N蛋白则通过胞质中游离核糖体翻译。

5. 病毒粒组装和释放

由核衣壳蛋白(N)和基因组RNA结合,形成复合体形态,该复合体可以通过结构蛋白M、E蛋白的相互作用,迅速被包裹到核衣壳中,随后S蛋白整合到病毒中,形成冠状结构(组装的病毒粒子)。病毒颗粒经内质网包装后形成囊泡,运输到内质网-高尔基中间体(ERGIC,ER-Golgi intermediate compartment)中,最后再转移到细胞膜处并与之融合,以出芽的方式从被感染的细胞中释放出去。

  • M蛋白的同型相互作用为病毒粒的形态生成提供了支架。
  • M-S和M-N相互作用促进了结构性蛋白向装配位点的募集。
  • E蛋白通过与M相互作用并诱导膜弯曲来促进颗粒组装。

参考文献

[1] Zhou P. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature, 2020.

[2] Fung T.S. and Liu D.X. Human coronavirus: host-pathogen interaction. Annual Review Microbiology, 2019.