10×Genomics技术是由10×Genomics公司和Fred Hutchinson癌症研究中心开发出一种单细胞RNA测序方法，该技术可实现数千个细胞的快速高效标记、测序和分析，获得单细胞水平的基因表达谱和差异情况，实现细胞群体的划分与细胞群体间差异表达基因的检测。

10×Genomics单细胞转录组测序的原理

10×Genomics平台基于微滴的核酸条形码分配系统，该系统提供了数以百万计级的携带唯一DNA条形码的微滴，通过微流控技术，首先将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴（GEMs）中。凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码和UMI信息的cDNA。液滴油层破碎，cDNA扩增，制备cDNA文库，然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。

技术核心–油滴包裹的凝胶珠（GEMs）

该系统有75万种barcoded beads，每个bead上有40-80万探针。

首先介绍（Gel bead）。Gel bead由凝胶珠和磁珠上的一段引物构成。Gel bead上连接的引物序列包含四个部分：Illumina TruSeq Read 1测序引物、16 nt的条形码（Barcode）、12 nt的UMI和30 nt的Poly(dT)反转录引物。

  • TruSeq Read 1测序引物，为一段已知的短肽核苷酸序列，用于后续的上机测序。
  • Barcode：有400万种Barcode，一个微珠对应一种Barcode，通过这400万种Barcode，可以把凝胶微珠给区分开。
  • UMI是由随机碱基组成的一段序列，每个DNA分子都有自己的UMI序列，在混合测序时，用于区分不同的样本。能够区分哪些reads是来自于一个原始cDNA分子，区分基因片段是重复还是duplication及区分是真实的单核苷酸多态性（SNP）位点还是PCR产生的突变。

Poly(dT)VN反转录引物，是含有30个T碱基的同聚DNA片段，一般具有启动子的作用。用于捕获有polyA尾的转录本。其能够在扩增末端自动加上三个C，在反应buffer中的TSO酶含有三个G会与c互补，完成二链扩增。

测序技术流程

1.将样本制备成单细胞悬浮液，细胞质检然后进行细胞计数和细胞活性测定，最终使细胞活性高于90%，细胞浓度为700～1200个细胞/μL。

2.取75μL Master Mix＋细胞悬浮液、40μL的含有barcode信息的凝胶珠和280μL的油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室，经由微流体“双十字”交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠（Gel Bead-In-EMulsions，GEMs）。有效的GEMs包含凝胶珠、单细胞、Master Mix和油。

3.收集GEMs，并将其全部混合，凝胶珠在每个油滴内自动溶解释放大量Barcode引物序列，细胞裂解释放mRNA，mRNA与逆转录酶、凝胶珠上的poly dT反转录引物以及dNTP底物相接触，在逆转录酶的作用下发生逆转录反应，产生用于测序的带有Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART扩增方法完成第二链合成。

4.cNDA片段化油滴破碎，磁珠纯化cDNA一链，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。

5.cDNA扩增完成后，首先利用化学方法将cDNA打断成200-300bp左右的片段，通过末端修复、加A进行cDNA片段筛选，P7 adaptor接头连接Read2测序引物，并通过PCR扩增引入样品Index，最后进行片段筛选，从而构建含有P5和P7接头的cDNA文库。

6.最后构建的文库结构如下：

7.文库完成以后，进行库检，cDNA文库库检合格后，直接在Illumina的测序仪上进行测序。测序完成之后，进行数据分析。

10×Genomics单细胞转录组测序优点

  • 简单便捷：集单细胞分选、扩增、建库于一体，自动化程度高，无需人工操作。
  • 细胞通量高：微流体“双十字”交叉系统为8通道系统，每个通道最高可捕获10000个细胞，8通道一次可检测样本细胞数可达500-80000个。
  • 细胞捕获效率高：单细胞捕获效率高达65%，可准确鉴别稀有细胞类型，利于稀有样本或小细胞量类型样本研究。
  • 周期短：理论上1天即可完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增及建库的所有的测序准备工作。
  • 真正意义的单细胞测序：单个GEMs捕获到多个细胞的概率极低（＜0.9%/1000cells）。
  • 性价比高：与其它单细胞测序平台相比，性价比更高。
  • 细胞可适性高：对细胞大小（直径超过40μm细胞需要制备细胞核）及细胞类型（组织类细胞、免疫细胞、血液细胞、癌组织细胞、神经类细胞等）无限制。

10×Genomics单细胞转录组测序缺点

  • 只分析带poly(A)的RNA。
  • 样本要求高：单个样本细胞起始量达105-106个，活细胞数目至少超过80%，最好在90%以上。
  • 非全长信息：只能获得3’端转录本信息。
  • DNA建库操作步骤较多。

10×Genomics单细胞转录组测序应用

  • 3’端单细胞转录组测序
  • 基因组组装应用
  • 免疫组库测序
  • ATAC-seq
  • 人全基因组及全外显子组测序