10×Genomics技术是由10×Genomics公司和Fred Hutchinson癌症研究中心开发出一种单细胞RNA测序方法,该技术可实现数千个细胞的快速高效标记、测序和分析,获得单细胞水平的基因表达谱和差异情况,实现细胞群体的划分与细胞群体间差异表达基因的检测。

10×Genomics单细胞转录组测序的原理

10×Genomics平台基于微滴的核酸条形码分配系统,该系统提供了数以百万计级的携带唯一DNA条形码的微滴,通过微流控技术,首先将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴(GEMs)中。凝胶珠溶解,细胞裂解释放mRNA,通过逆转录产生用于测序的带条形码和UMI信息的cDNA。液滴油层破碎,cDNA扩增,制备cDNA文库,然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测,即可获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。

技术核心–油滴包裹的凝胶珠(GEMs)

该系统有75万种barcoded beads,每个bead上有40-80万探针。

首先介绍(Gel bead)。Gel bead由凝胶珠和磁珠上的一段引物构成。Gel bead上连接的引物序列包含四个部分:Illumina TruSeq Read 1测序引物、16 nt的条形码(Barcode)、12 nt的UMI和30 nt的Poly(dT)反转录引物。

  • TruSeq Read 1测序引物,为一段已知的短肽核苷酸序列,用于后续的上机测序。
  • Barcode:有400万种Barcode,一个微珠对应一种Barcode,通过这400万种Barcode,可以把凝胶微珠给区分开。
  • UMI是由随机碱基组成的一段序列,每个DNA分子都有自己的UMI序列,在混合测序时,用于区分不同的样本。能够区分哪些reads是来自于一个原始cDNA分子,区分基因片段是重复还是duplication及区分是真实的单核苷酸多态性(SNP)位点还是PCR产生的突变。

Poly(dT)VN反转录引物,是含有30个T碱基的同聚DNA片段,一般具有启动子的作用。用于捕获有polyA尾的转录本。其能够在扩增末端自动加上三个C,在反应buffer中的TSO酶含有三个G会与c互补,完成二链扩增。

测序技术流程

1.将样本制备成单细胞悬浮液,细胞质检然后进行细胞计数和细胞活性测定,最终使细胞活性高于90%,细胞浓度为700~1200个细胞/μL。

2.取75μL Master Mix+细胞悬浮液、40μL的含有barcode信息的凝胶珠和280μL的油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室,经由微流体“双十字”交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠(Gel Bead-In-EMulsions,GEMs)。有效的GEMs包含凝胶珠、单细胞、Master Mix和油。

3.收集GEMs,并将其全部混合,凝胶珠在每个油滴内自动溶解释放大量Barcode引物序列,细胞裂解释放mRNA,mRNA与逆转录酶、凝胶珠上的poly dT反转录引物以及dNTP底物相接触,在逆转录酶的作用下发生逆转录反应,产生用于测序的带有Barcode和UMI信息的cDNA一链,再以SMART扩增方法完成第二链合成。

4.cNDA片段化油滴破碎,磁珠纯化cDNA一链,然后以cDNA为模板进行PCR扩增。

5.cDNA扩增完成后,首先利用化学方法将cDNA打断成200-300bp左右的片段,通过末端修复、加A进行cDNA片段筛选,P7 adaptor接头连接Read2测序引物,并通过PCR扩增引入样品Index,最后进行片段筛选,从而构建含有P5和P7接头的cDNA文库。

6.最后构建的文库结构如下:

7.文库完成以后,进行库检,cDNA文库库检合格后,直接在Illumina的测序仪上进行测序。测序完成之后,进行数据分析。

10×Genomics单细胞转录组测序优点

  • 简单便捷:集单细胞分选、扩增、建库于一体,自动化程度高,无需人工操作。
  • 细胞通量高:微流体“双十字”交叉系统为8通道系统,每个通道最高可捕获10000个细胞,8通道一次可检测样本细胞数可达500-80000个。
  • 细胞捕获效率高:单细胞捕获效率高达65%,可准确鉴别稀有细胞类型,利于稀有样本或小细胞量类型样本研究。
  • 周期短:理论上1天即可完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增及建库的所有的测序准备工作。
  • 真正意义的单细胞测序:单个GEMs捕获到多个细胞的概率极低(<0.9%/1000cells)。
  • 性价比高:与其它单细胞测序平台相比,性价比更高。
  • 细胞可适性高:对细胞大小(直径超过40μm细胞需要制备细胞核)及细胞类型(组织类细胞、免疫细胞、血液细胞、癌组织细胞、神经类细胞等)无限制。

10×Genomics单细胞转录组测序缺点

  • 只分析带poly(A)的RNA。
  • 样本要求高:单个样本细胞起始量达105-106个,活细胞数目至少超过80%,最好在90%以上。
  • 非全长信息:只能获得3’端转录本信息。
  • DNA建库操作步骤较多。

10×Genomics单细胞转录组测序应用

  • 3’端单细胞转录组测序
  • 基因组组装应用
  • 免疫组库测序
  • ATAC-seq
  • 人全基因组及全外显子组测序