单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合为既能稳定生长又能产生抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体具有理化性状高度均一(纯度高、有效抗体含量高)、生物活性单一、与抗原结合特异性强、来源容易、制备成本低等优点,并且可用于疾病的诊断和治疗。

单克隆抗体制备原理:

抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,含遗传基因不同的B淋巴细胞可以合成不同的抗体。当机体受外界抗原刺激后,可诱发免疫反应,产生相应的抗体,即单克隆抗体。B淋巴细胞能够产生抗体,但在体外不能进行无限分裂;肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代,是“永久”的细胞,但不能产生抗体。因此将骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合,融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性,一方面可以分泌特定的抗体,另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力,可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖,从而分泌大量单克隆抗体。

单克隆抗体制备流程:

1、免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄Balb/c健康雌性小鼠,按照预先指定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。(抗血清制备——免疫动物

2、脾细胞的准备

  • 拉颈处死小鼠
  • 无菌操作取出脾脏
  • 清洗研磨,收集细胞
  • 离心洗涤
  • 细胞计数

3、骨髓瘤细胞的准备

  • 收集细胞
  • 离心洗涤
  • 活细胞计数
  • 调整细胞浓度

4、细胞融合

  • 骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合1:10或1:5。
  • 加入50% PEG促融剂(在PEG作用下B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞)。
  • 加入不完全培养液,终止PEG的融合作用,离心,弃上清。

5、杂交瘤细胞的选择性培养

在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT和TK,不能利用补救途径合成DNA而死亡,未融合的B淋巴细胞虽具有HGPRT和TK,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合的杂交瘤既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力,又从免疫B细胞得到HGPRT和TK的基因产物,因此能在HAT选择培养基中存活和繁殖。

  • 在用HAT选择培养1~2天内,将有大量瘤细胞死亡,3~4天后瘤细胞消失,可见外形似骨髓瘤细胞,浑圆透亮的杂交瘤细胞形成小集落。
  • 观察杂交瘤细胞生长情况,待其布满孔底1/10面积时,即可取培养上清,检测特异性抗体。

6、筛选分泌抗体的杂交瘤细胞

杂交瘤细胞在融合后2周即可开始筛选抗体活性,通常根据所研究抗原的特点和实验室的条件,选择不同类型的方法。包括:免疫荧光法、放射免疫(RIA)法、组织化学法和酶联免疫分析(ELISA)法等,其中最常用的方法是ELISA法。

7、杂交瘤细胞克隆化

在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化。克隆化——即把培养孔中的细胞从单个细胞进行培养繁殖,使之成为单克隆,其分泌的抗体达到均一性。

8、单克隆抗体的大量制备

(1) 动物体内诱生法

  • 取Balb/c小鼠,腹腔注射降植烷或液体石蜡进行预处理。
  • 腹腔注射接种杂交瘤细胞。
  • 约1~2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可获得大量单克隆抗体。

(2) 体外培养法

  • 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞。
  • 从上清液中获取单克隆抗体,一般培养液含量为10~60μg/mL。
  • 离心,去除细胞及其碎片,即可获得单克隆抗体。

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