抗血清是一种含有高效价特异性抗体的血清,一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。通过注射抗血清可以传递被动免疫治疗许多疾病。

抗血清制备原理:

将抗原注射于动物体,将引起免疫应答。可刺激动物的淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体,待血清中积累大量抗体时,采集动物血液并分离析出血清,此即含抗体的免疫血清(抗血清)。抗血清包括抗细菌、抗毒素、抗病毒血清。

抗血清制备步骤:

1、选择免疫动物

  • 免疫动物一般选择青壮年期、健壮雌性个体。
  • 抗原与免疫动物的种属差异越远越好。
  • 针对不同性质的免疫原选择相应的动物。
  • 制备H血清用马,制备R血清用兔,制备补体用豚鼠血清。

2、抗原制备

  • 抗原剂量:用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/mL,与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。
  • 免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。通常小鼠首次抗原剂量为50~100μg/次,大鼠为100~200μg/次,兔为100~1mg/次,合成免疫原为2mg(半抗原约为20~200μg),一般需要与等量的福氏完全佐剂混合。加强免疫原与福氏不完全佐剂混合或不用免疫佐剂,剂量为首次计量的1/2。
  • 抗原乳剂的配制:将等量的佐剂与抗原溶液倒入钵内,经过反复碾磨,形成油包水乳剂。制成的油包水乳剂直接影响免疫效果,因此使用前需进行质量检查。检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面,质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整不分散,不合格的乳剂立即扩散,水面油亦逐渐扩大。若检查不合格,则须继续操作至质量合格为止。

3、确定免疫方案

  • 根据免疫目的的要求、抗原性质、佐剂种类来制定免疫方案。可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。免疫接种途径通常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、淋巴结等接种途径,对抗原的吸收速度为静脉=腹腔=淋巴结>肌肉>皮下>皮内。若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法;半抗原宜皮内多点注射。免疫接种剂量应根据分子量大小、免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间决定。
  • 免疫间隔时间:第一次与第二次免疫的时间间隔一般以10~20天为佳,二次以后间隔时间一般为7~10天。

4、免疫动物(常规免疫方法–皮内多点注射)

  • 第一次免疫:剂量为每只兔子注射1.0mL抗原乳剂(含抗原量1~2mg)。注射部位为两只后脚掌的皮内各注射0.2mL,其余0.6mL分多点注入脊椎二侧、颈部、腹股沟和腋窝等处淋巴结附近部位皮内,每点可注入0.05mL,分12次注入。
  • 第二次免疫:初次免疫后20天左右,剂量为1.0mL/只,加福氏不完全佐剂。注射部位在腹部皮下多点注射,每点注入0.1mL。
  • 第三次免疫:二次免疫7~10天后,注射部位和剂量同第二次免疫。
  • 试血:末次免疫5~7d后,抽取少许静脉血,分离血清后进行试血。采用免疫双扩散法测定效价在1:16以上即可放血,若效价较低,可继续加强免疫。

5、采血分离血清

  • 放血:放血前动物应停食12h,如拟保留该免疫动物,可直接由心脏取血或切开耳缘静脉滴血或心脏穿刺取血。取血后由静脉缓缓注入等量5%葡萄糖溶液以补充失血量。取血的动物经2~3个月休息,可再次加强免疫后取血;如拟一次放血致死,可用颈动脉放血的方法。
  • 分离血清:在无菌条件下,待血液自然凝固后,静置4℃冰箱,待血清析出后,经离心沉淀分出血清。

6、抗血清的鉴定与保存

  • 抗体特异性鉴定:鉴定方法常采用双向免疫琼脂扩散技术。
  • 血清抗体效价测定:测定方法常用的是放射免疫法和免疫双扩散法。
  • 抗体纯度鉴定:采用SDS-PAGE法进行纯度鉴定。
  • 抗血清的纯化:常见的纯化方法是提取特异性IgG。特异性IgG抗血清制备:首先用硫酸铵或硫酸钠盐析法粗提丙种球蛋白,再进一步纯化。粗提法提取γ球蛋白:采用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法,硫酸铵盐析法须经多次沉淀,经三次提取后的γ球蛋白大多属于IgG。
  • 抗血清的保存:将鉴定合格后的抗血清,以1:100的比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠,使其最后浓度分别为0.01%或0.05%。用无菌滴管将抗血清分装小管,每管装约1mL,置于4℃保存,可保存3个月~6个月;-70℃~-20℃保存可保存2~3年;真空冰冻干燥保存,可保存4~5年。

实验流程图

主要仪器试剂

  • 抗原与免疫对象:抗原、健康家兔。
  • 试剂:生理盐水、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、注射器、石炭酸、防腐剂(1%的硫柳汞或5%的叠氮钠)等。
  • 设备与器材:剪刀、镊子、注射器等器材和冰箱、离心机等设备。

注意事项:

  1. 动物的免疫反应存在个体差异,因此制备血清时,应同时免疫3~4只。
  2. 为制备单价特异性高的抗血清,所用抗原纯度越高越好,因此在纯化抗原过程中应尽可能除去可能存在的杂蛋白。
  3. 要制备高效价的抗体,必须要加佐剂,但若抗原中存在杂蛋白,则可能因佐剂的存在而产生非特异性的抗体,所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂。
  4. 制成的抗原乳剂是否为油包水乳剂应进行检查,否则会影响免疫效果,若不是油包水乳剂,应重新制备。
  5. 当抗原量过少不易提纯时,可采用抗原抗体在琼脂扩散中形成的沉淀线直接免疫动物制备抗体。
  6. 抗血清效价一般以抗血清稀释倍数表示。血清效价检测方法很多,灵敏度各不同,在表示抗血清效价时,应注意标明检测方法。
  7. 分装保存的抗血清应标明抗血清的名称、效价、制备日期以及包装量。

抗血清的应用

  1. 疾病的紧急预防与治疗:当动物接种相应抗血清后,机体迅速得到大量非自身免疫抗体,从而快速中和侵入人体的病原,如抗猪瘟血清能有效控制猪瘟的疫情,抗犬瘟热血清对犬瘟热有独特的疗效。
  2. 疾病诊断和病原鉴定:血清学诊断方法在疾病诊断和病原鉴定中具有十分重要的地位,其中采用高效价特性的抗血清(阳性血清)作为反应的诊断物是血清学诊断方法的重点。如口蹄疫细胞中和试验性血清、日本血吸虫病凝集试验阳性血清、衣原体病间接血凝试验阳性血清等。
  3. 抗血清还可用于微生物的鉴定、抗原的分析、免疫球蛋白的鉴定以及其他蛋白质的鉴定与研究。