ELISA酶联免疫吸附实验是将已知的抗原或抗体结合在固相载体表面,然后利用酶标记(偶联)的抗体或抗原与之孵育,在通过显色物显色,其显色深浅与待测物质的含量成正比,用肉眼即可观察。在ELISA实验中,有三种必需的试剂:已知的抗原或抗体(用于结合到固相载体上);酶标的抗体或抗原(标记物);显色剂(用于显色)。
常见的ELISA实验有四种:直接ELISA间接ELISA夹心ELISA竞争ELISA
ELISA技术

直接ELISA (Direct ELISA)

直接ELISA法是将抗原固定于ELISA板上,然后用酶标抗体直检测抗原。
相较于其它类型的ELISA实验,直接ELISA实验步骤少,检测速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反应,测定结果不容易出错。但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的,样本中的所有蛋白质(靶蛋白及其他杂质蛋白)都会与ELISA板结合,实验背景会比较高。而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗,实验不太灵活。另外由于没有使用二抗,信号没有被放大,降低了测定的灵敏度。
对抗原的免疫反应进行分析,通常会使用直接ELISA。

总结:

优点 缺点
  • 步骤少,实验周期更短
  • 较低的交叉反应,实验不容易出错
  • 背景高
  • 灵活性差,需要针对每种靶蛋白的特异性一抗
  • 检测灵敏度不够高:没有使用二抗,信号没有放大
  • 最佳用途:分析抗原的免疫反应

间接ELISA (Indirect ELISA)

间接ELISA法是先将抗原结合到ELISA板上,随后分两步进行检测:首先加入检测抗体与抗原特异性结合,随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。
与直接ELISA相比,间接ELISA用到酶标二抗,具有更高的灵敏度,也需要更少的标记抗体,更经济。间接ELISA还提供了更大的灵活性,因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。间接ELISA实验的缺点是存在交叉反应的可能性(酶标二抗直接与抗原结合),可能会增加背景,同时与直接ELISA相比,间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤,实验周期增长。
间接ELISA法适合测定样品中总抗体的浓度。

总结:

优点 缺点
  • 高灵敏度
  • 更经济
  • 更灵活
  • 可能存在交叉反应
  • 比直接ELISA法实验周期长
  • 最佳用途:测定样品中总抗体的浓度

夹心ELISA (Sandwich ELISA)

夹心ELISA实验需要用到配对抗体(捕获抗体和检测抗体),其实验原理是将捕获抗体结合到ELISA板上,通过捕获抗体固定抗原,随后通过直接ELISA或间接ELISA的方式进行检测,实验流程如下图所示。在夹心ELISA实验中,最重要的是对配对抗体进行验证,确保配对抗体能同时与抗原结合,以确保实验的顺利进行。
夹心ELISA实验先将捕获抗体固定于ELISA板孔中,然后加入分析物或样品,接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体,则可称为直接夹心ELISA;如果检测抗体不带有标记,则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合,这种称为间接夹心ELISA。夹心ELISA的灵敏度高,它比直接或间接ELISA敏感2-5倍;同时夹心ELISA使用两种特异性抗体与抗原结合,拥有很高的特异性。另外夹心ELISA能够通过直接或间接的方式进行检测,有着不错的灵活性。夹心ELISA的缺点是对配对抗体要求很高,如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体,则需要进行配对抗体定制并进行优化,因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。
夹心ELISA尤其适用于复杂样品的分析,因为抗原不经纯化仍具能有高灵敏度和特异性(例如测量免疫应答中的细胞因子水平)。

总结:

优点 缺点
  • 灵敏度高
  • 特异性好
  • 更灵活
  • 对于配对抗体的要求高(了解更多配对抗体
  • 最佳用途:对复杂样品进行分析

竞争ELISA (Competition ELISA)

竞争ELISA也成为阻断ELISA,是所有ELISA实验中最复杂的,但是以上介绍的三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式。竞争ELISA主要用于通过检测对预期信号输出去测量样品中抗原或抗体的浓度:
在竞争ELISA实验中,样品中的抗原或抗体竞争性的结合特定数量的酶标抗体或抗原。样品中抗原浓度越高,输出信号越弱,信号输出与样品中抗原的量成反比。

总结:

优点 缺点
  • 无需样品处理,可检测原油或不纯的样品
  • 重复性好:重复样品和分析之间的差异更小
  • 灵活性高:可基于直接、间接或夹心ELISA
  • 更稳健:对样品稀释和样品基质效应的敏感性低于夹心ELISA
  • 操作繁琐
  • 最佳用途:常用于只有一种抗体可用于目标抗原的情况,也适用于检测不能被两种不同抗体结合的小抗原