单克隆抗体制备中,成功获得杂交细胞后,除对阳性孔进行克隆化、扩大培养外,也要及时冻存阳性孔的杂交瘤细胞,以免细胞传代培养过程中发生突变、污染或出现细胞分泌抗体能力丧失等不良后果。

杂交瘤细胞的冻存实验步骤

  1. 将冻存液保存于4℃冰箱备用,冻存管高压灭菌备用。
  2. 选择生长旺盛、饱满透明的杂交瘤细胞,用无菌滴管吹下,2000r/min离心5min,弃去上清液。
  3. 将细胞沉淀物悬于预冷的细胞冻存液中,制成2~6×106个/mL细胞悬液。并分装于细胞冻存管,每只1mL。
  4. 冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时,一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中;或细胞管降至0℃后放入-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中;也可以用细胞冻存装置进行冻存。

杂交瘤细胞的复苏实验步骤

  1. 将水浴锅预热37℃,细胞培养液提前预热,取5~10mL于15mL离心管中。
  2. 从液态氮中取出冷冻管,立即投入37℃水浴锅中,轻轻摇动,在1~1.5min内使冻存的细胞解冻。
  3. 取出后,用75%乙醇消毒管外壁,放入超净台,将细胞转移到含5~10ml不完全培养液的15ml离心管中, 800~1000r/min离心5min。
  4. 弃上清,加入细胞培养液,移入事先准备好的含有饲养层细胞的培养瓶中。轻轻摇动培养瓶,使细胞分散均匀,然后将培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。
  5. 根据细胞生长速度,2~3天更换一次培养液,当细胞形成集落时,检测抗体活性。

实验材料及仪器

实验材料及仪器

实验材料:稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

实验仪器:无菌滴管,培养瓶等器材,冰箱、培养箱、离心机,超净工作台等设备。

培养液配方:

细胞冻存液:50%胎牛血清,10%二甲基亚砜,40%RPMI-1640培养基

细胞冻存液:50%胎牛血清,10%二甲基亚砜,40%RPMI-1640培养基,细胞培养液:20%胎牛血清,75%RPMI-1640培养基,1%谷氨酰胺,1%双抗,最后用8.8%NaHCO3调培养液pH至7.2~7.4。

注意事项

  • 冻存液最好预冷,操作时动作要轻且迅速。
  • 冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性。
  • 保证细胞培养液新鲜,采用少量多次配制,或培养基保存于-20℃冰箱。
  • 细胞冻存与复苏的原则是慢冻快复,最大程度的保证细胞复苏的成功率。