抗体配对是在抗体的基础上，对抗体进一步的开发应用。其中参与配对的抗体能够同时结合相同的抗原。通常情况下，一个抗原分子拥有多个抗原决定簇，将抗原直接注入到动物体内，可引起免疫反应产生抗体，针对不同的抗原决定簇会产生不同的抗体。产生的抗体具有特异性与专一性，即一个抗体分子只会特异性地结合一个抗原决定簇。两个针对不同抗原决定簇的抗体，有可能同时结合到同一个抗原分子上，像这种结合到同一抗原分子上的两个抗体就是配对抗体。
需要注意的是，即使两个抗体针对的是同一抗原分子上不同的抗原决定簇，也并不意味着这两个抗体分子一定可以同时与抗原分子结合。当一个抗体与抗原结合后，有可能会导致其他结合位点（抗原决定簇）构型的改变，从而导致其他的抗体无法正常结合到抗原上。此外，由于位阻效应的存在，也可能使两个结合位点距离较近的抗体无法同时结合在抗原上。因此，想要得到可以同时结合在抗原分子上的配对抗体，在制备出抗体后，还需要对抗体进行筛选。
HRP酶标抗体制备
实验步骤——过碘酸钠氧化法：
- 称取5mgHRP酶，溶于0.5mL蒸馏水中
- 加入新配制的0.5mL（0.1mol/L）过碘酸钠溶液，4℃静置30min
- 加入0.5mL（0.16mol/L）乙二醇溶液，室温避光混匀，静置30min
- 加入含5mg抗体的水溶液1mL，混匀装入透析袋，pH9.5碳酸盐缓冲液透析，放4℃，过夜
- 加入0.2mL新配制的（0.5mg/mL）硼氢化钠溶液，混匀，4℃静置2h
- 边搅拌边滴加等体积饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h
- 3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤2次
- 沉淀物溶于少量pH7.4（0.15mol/L）磷酸盐缓冲液，透析过夜，去除铵离子后，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物
注意事项：
- 为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中的抗体含量。
- ELISA法测定酶标抗体效价。
- 碘酸钠要新鲜配制。
配对抗体的筛选——双抗体夹心ELISA法
取两种效价高的单克隆抗体，一种作为捕获抗体，另一种作为标记抗体（HRP酶标抗体），将捕获抗体包被在固相载体上，先加入抗原，孵育后洗去未结合的抗原，使固相载体上形成抗体抗原复合物，并于液体中的其他物质分开。再加入标记抗体，孵育后洗去未结合的标记抗体，最后加入显色液显色。
- 如果可以显色，说明该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。可进一步根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
- 如果不能显色，说明该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体。如果选择的两种单克隆抗体不能进行配对，则需重新选择两种单抗，重新进行试验，直至找出可以配对的抗体。
配对抗体筛选流程：
实验步骤：
- 稀释：用pH9.6（0.01mol/L）碳酸盐缓冲液将单克隆抗体稀释至5μg/mL
- 培养：用捕获抗体包被酶标板后，4℃过夜
- 洗涤：用PBS/T20洗板3次，每次3min
- 封闭：用含3%小牛血清的PBS/T20封闭，37℃孵育1h，洗板
- 加抗原：加入倍比稀释的抗原溶液，37℃孵育45min，洗板
- 加酶标抗体：加入HRP-单克隆抗体，37℃孵育30min，洗板
- 显色：加入TMB显色液，轻轻震荡混匀，37℃避光反应15min
- 终止：加入50μL终止液终止反应
- 测定：酶标仪上读取各孔读取OD450值
注意事项：
- 加样品与酶标板时，应加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
- 注意避光显色。
- 测定应在加终止液后15min以内及时测定。。
实验试剂及仪器
实验试剂：HRP酶、过碘酸钠、乙二醇、碳酸盐缓冲液、硼氢化钠、硫酸铵溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、PBS/T20、HRP-单克隆抗体、TMB显色液。
实验仪器：离心机、冰箱、酶标仪。
抗体配对的应用
抗体配对常应用于双抗体夹心ELISA实验。能够对目的抗原进行定性定量检测，具有高灵敏度，高特异性及高稳定性的优点，可实现大批量稳定生产。