Flag标签系统是利用DNA重组技术将一个短的亲水性八肽(DYKDDDDK)融合到目标蛋白中,从而形成融合蛋白。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于各种细胞类型,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。而利用相应的Flag标签抗体可对融合蛋白进行检测和纯化,并且能够大大提高目的蛋白的纯化效率。

Flag标签

作用原理

  • Flag序列的第二个氨基酸是酪氨酸(Tyr),属于芳香族氨基酸,是影响抗原-抗体特异性反应的主要因素;
  • 位于N端带负电的天冬氨酸(Asp)可辅助酪氨酸的抗原性;
  • 靠近C端的六个氨基酸( Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)组成一个亲水序列,能形成高度暴露的三位蛋白质构型,在理论上可使序列达到最大的亲水性,大大增强了Flag融合标签的抗原性。

Flag标签优势

  • 序列短小,只用一条人工合成的寡核苷酸链就可以编码;
  • 结晶条件下Flag融合蛋白的构象与单纯目的蛋白的构象几乎完全相同,通常不会与目的蛋白相互作用,并且对目的蛋白的性质和功能影响很小,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究;
  • 融合有Flag标签的目的蛋白,可以直接通过Flag标签进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高;
  • 抗Flag的抗体可有效识别Flag标签,这样就方便通过 Western blot、ELSA等方法对含有Flag的融合蛋白进行检测、鉴定;
  • Flag融合标签含有一个肠激酶切割位点,肠激酶可以识别该短肽C端的五个氨基酸( Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),通过肠激酶处理除去标签后即可获得天然的非融合蛋白质。

融合标签的切除

  •  肠激酶:一般用肠激酶切除融合蛋白结合在N端的Flag标签。肠激酶可精确识别DDDDK这5个氨基酸残基所组成的序列,Flag标签( DYKDDDDK)内部就含有一个肠激酶切割位点。肠激酶具有活性高、适应pH范围广的特点,且在多种变性剂和清洁剂浓度下均可进行切割,切割后产物不含多余氨基酸。
  • 凝血酶:一种应用很广泛的蛋白酶,主要特点是经凝血酶切割后的重组蛋白在切割位点的C端会保留两个氨基酸残基。凝血酶可以识别两种类型的氨基酸序列,分别为X4-X3-P-P[K]-X1΄-X2΄和X2-R[K]-X1΄,凝血酶对前一种序列的识别效果更为理想。
  • Xa因子:Xa因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶,可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列,并将融合标签从其C末端切除。

抗Flag标签抗体

目前有3种Flag标签抗体研发并在市面上投入使用,分别为M1、M2、M5。

  • M1单抗应用最早,反应的前提是:必须在Ca2+的参与下才能和Flag抗原结合;只能作用于N末端Flag融合蛋白;要求在N端有自由氨基。
  • M2单抗克服了M1依赖Ca2+的缺陷,避免了螯合剂作用于吸附柱上的抗原-抗体复合物,且可应用于N端Met-Flag和C端Flag融合蛋白质。
  • M5单抗不依赖于Ca2+,多应用于类似N-Met-Flag-C的序列,对融合蛋白的亲和力非常高,是用于检测在细胞质表达的Flag融合蛋白质的首选抗体。

Flag抗体的作用

  • 用于融合蛋白的检测和纯化:在抗融合标签的单克隆抗体的参与下,可直接通过酶联免疫吸附实验( ELISA)、免疫印迹(WB)等方法检测表达产物的蛋白质水平;抗融合标签抗体可进行相应融合蛋白的纯化。在抗体和目的蛋白的特异性结合条件下,蛋白的亲和纯化效率会显著提高。
  • 用于寻找相互作用的蛋白质:抗标签的抗体在荧光标记后可以用于寻找与融合蛋白相互作用的蛋白质(包括目的蛋白的配体或受体);可利用标签抗体沉淀与目的蛋白相互作用的蛋白质,并通过进一步的分离、纯化与鉴定,即可的到与目的蛋白相互作用的蛋白质的信息。
  • 用于探索蛋白质的结构和功能:抗标签抗体可以用来研究蛋白质分子的功能,特别是用来研究膜受体的功能,因此,在实验中可以利用抗标签蛋白抗体的交联活化受体,代替天然配体来研究受体的信号转导或功能;将标签插入信号转导分子的特定结构域还可以用来研究分子的信号转导途径。

参考文献

【1】王云龙,李忠信,李恒思等. Flag标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究 [D]. 2010

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