氨基酸序列是单抗药物的一级结构,是单抗药物研究的基础。但是由于专利保护等原因,在专利期内的单抗药物氨基酸序列较难获得,成为研发中的一大瓶颈。因此,快速、准确获取完整的抗体序列信息具有十分重要的意义。基于软电离技术的开发,质谱逐渐发展成为研究蛋白质药物的重要手段。铭研生物利用Bioinformatics Assisted De novo Sequencing (BADS) 技术,以最先进的质谱仪和强大的数据处理算法,生成大量序列信息,进而运用最新计算程序对MS/MS光谱从头测序,利用其独特的内部数据挖掘工具保证从上万条MS/MS光谱数据中提取目标抗体序列信息,从而完成抗体测序。同时,其拥有自建的高通量表达验证平台,能够对已测得的抗体序列进行高通量表达验证,从而保证交付抗体的活性。

抗体测序基本流程

1.切除蛋白质的N-糖基化修饰

取50μg待测样品于超滤管中,加入200μl NH4HCO3溶液(50mmol/L),在4℃条件下12000rcf离心10min,重复3次,再加入NH4HCO3与二硫苏糖醇(DTT)溶液,37℃孵育3h,使蛋白还原。加入碘乙酰胺(IAA)溶液,避光反应40min,4℃条件下12000rcf离心10min。NH4HCO3溶液离心清洗两次后,加入5μl PNGaseF酶溶液,在37℃条件下酶切16h,最后SDS-PAGE电泳。

2.酶切抗体

将电泳后的目的条带切成1mm3的胶粒,经乙腈(CAN)溶液与NH4HCO3溶液(浓度均为50mmol/L)脱色后,用DTT(10mmol/L)与IAA(55mmol/L)溶液还原烷基化,脱色液再次清洗后,加入100μl ACN溶液(100%),静置30min,弃去ACN。

干燥后加入酶溶液进行酶切,采用5-8种酶(如胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C以及为了鉴定到N-糖基化位点而进行的PNGase F酶串联胰蛋白酶等)酶切抗体蛋白,将一个完整的抗体酶切成大小不同的肽段混合物。利用不同酶切肽段之间的互补性实现抗体分子轻重链100%全序列的拼接。

3.质谱分析

铭研生物采用高分辨率和精确度的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪,对肽段混合物进行质谱分析。相对于老一代的质谱仪,其在提高一级和二级质谱扫描速度的同时也保证了肽段分子的准确性。一级质谱扫描速度的提高,有助于一个肽段更多次的被鉴定到,提高了结果的可信度;二级质谱扫描速度的提高可以更好的进行片段碎裂,从而保证结果的准确性,并且可以通过二级碎裂片段的特征峰实现亮氨酸和异亮氨酸的准确判定。

质谱检测步骤

  • 肽段用样品溶解液溶解,充分涡旋振荡
  • 13200rpm条件下离心10min,取上清进行质谱鉴定。
  • 选择谱峰质量较好的MS/MS图,利用软件对质谱数据进行必要的背景去除。根据碎片离子峰的“三联套”规律,在MS/MS图谱中找到连续的碎片离子峰:a、b和c,y和z,确定离子的归属,同系列中相邻成套碎片离子峰间的质量数之差一般代表一个氨基酸残基。

等重氨基酸区分

与其他基于MS测序方法不同的是,BADS技术平台可以分辨大多数等重氨基酸复合物。 如:W可从GE、AD、SV中区别出来;R可从GV中区别出来;Q可从GA、K中区别出来;N可从GG中区别出来。

4.生物信息学辅助分析

采用生物信息学的方法分析得到的质谱数据,根据重复序列拼接得到完整的抗体蛋白氨基酸序列,再根据抗体轻链和重链的全序列覆盖图对测序结果质量进行评价,最后对序列进行反向验证。

5.高通量表达验证

采用自建的高通量表达验证平台,对已测得的抗体序列进行高通量表达验证,从而保证交付抗体的活性。
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