噬菌体抗体库技术是由抗体基因文库技术和噬菌体表面展示技术相结合而形成的一项新的基因工程抗体技术。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体,在病毒感染疾病及肿瘤诊治方面均具有重要的应用价值。

基本原理

利用PCR技术从人免疫细胞中扩増出整套的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样噬菌体DNA中有抗体基因的存在,同时在其表面又有抗体分子的表达,这样利用抗原-抗体特异性结合即可筛选出目的基因,并进行克隆扩增。使抗体基因以分泌的方式表达,则可获得可溶性的抗体片段。

噬菌体抗体库构建流程

构建噬菌体抗体库通常包括以下几个步骤:

  1. 从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞,提取mRNA并反转录为cDNA;
  2. 应用抗体轻链和重链引物,根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的基因片段;
  3. 构建噬菌体載体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种,其中丝状噬菌体和噬菌粒是目前构建表面表达的噬菌体抗体库常用载体;
  4. 表达载体转化细菌构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲和吸附-洗脱-扩増最终筛选岀抗持异的抗体克隆。

噬菌体抗体库的分类

根据抗体基因的来源和组成不同,噬菌体抗体库可分为天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库以及合成抗体库。

  • 天然抗体库(Native antibody library):抗体基因片段来自未经免疫的供体,该文库代表了供体内天然的抗体谱;
  • 免疫抗体库(Immunized antibody library):抗体基因片段克隆自经抗原免疫过的供体,该文库一般具有较强的抗原特异性和亲和力;
  • 半合成抗体库(Semi-synthetic antibody library):该文库抗体重链可变区基因片段中CDR1和CDR2来自人胚系VH片段,而CDR3则是人工合成的编码5~15个氨基酸的随机序列,该文库容量极大,可达1012,但抗体的亲和力较低,同时人工合成的CDR3可能增加抗体的免疫原性;
  • 合成抗体库(synthetic antibody library):在对人或鼠抗体序列和主体结构进行分析的基础上,合成多条VH和VL基因,用来替代所有的抗体类别和结构,组成多个总抗体库。其CDR区可通过限制酶方便地更换,该库便于进行分子模拟和结构预测,不足之处是操作复杂,且所获得抗体的免疫源性往往较高。

  • 模拟天然全套抗体库:抗体文库可以达到或超过1011库容,所以能包含B细胞全部克隆;建库的外源基因来自人体外周血骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的 mmDNA ,mmDNA反转录形成CDNA,这些mRNA是人体多克隆细胞的总mRNA;使用的通用引物采自多个人体,具有人的种属普遍性;抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。
  • 避免使用人工免疫和杂交瘤技术:由于抗体库的大容量和极高的筛选效率,使得可以调出任意抗体基因;用基因工程方法制备抗体从而避免了使用人工免疫动物和细胞融合技术。
  • 可获得高亲和力的人源化抗体:在噬菌体抗体库技术中,VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程,所用的抗体基因又来自人体,因此,所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。

噬菌体抗体库的应用

噬菌体抗体库技术自问世以来,其广泛的应用前景和较大的发展潜力就受到了关注。噬菌体抗体库技术不仅提高了制备较大数量抗体的能力,同时可对抗体加以改造以满足诸如亲和力、免疫原性等抗体质量方面的要求。

1.制备小分子抗体

目前已根据抗体的不同功能和应用需求制造了多种不同形式的抗体,如ScFv、Fab抗体、双特异抗体等。与传统的完整抗体相比,ScFv、Fab抗体因其分子较小,是已构建的噬菌体抗体库中较为常见的两种类型。其易于原核细胞表达以及进行基因工程改造,可在多种表达系统中表达,同时不含Fc段,可以减少广泛分布的Fc受体的不利影响等。

2.制备人源化抗体

鼠源性抗体应用于人体时,会产生人抗鼠抗体,极大地限制了鼠源性单抗的应用和发展,因此进行了鼠源性单抗人源化的研究。

最初人们用免疫动物的方法构建噬菌体抗体库,从制备的免疫文库中筛选获得特异性抗体。随着研究的不断深入,研究者将人B淋巴细胞的VH和VL基因片段,通过RT-PCR技术进行克隆和扩增,并随机组合到人表达载体,建立了容量巨大的抗体库。这一技术很好地解决了人体杂交瘤低效的缺陷,简单易行,筛选容量大,为完全人源化抗体的制备提供了新途径。

3.改良抗体性能

噬菌体抗体库技术突出的优势之一便是具备改良抗体的能力。能够以某种特定性能为目标,在尚不知道具有该性能肽段的一级结构的情况下,通过突变建库筛选,获得具备该性能或性能得到改善的未知序列。抗体库可以通过引入突变或筛选高亲和力克隆,在体外模拟体内的抗体亲和力成熟过程,提高抗体亲和力。

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