GST融合蛋白的表达与纯化

纯化实验方法

材料准备:菌种,雌性小鼠(6~8周龄),LB液体培养基,氨苄青霉素,细菌裂解缓冲液,吸附缓冲液,洗脱缓冲液等(材料未详细列出,可根据实验sop进行准备)

GST蛋白提取步骤

  • 复苏菌液:在无菌条件下取10ml LB液体培养基,加入1%体积的菌液,1‰体积的氨苄青霉素(Amp),37℃培养箱振荡培养过夜;
  • 诱导表达:取500ml LB液体培养基,加1%体积复苏好的菌液,1‰体积的氨苄青霉素(Amp),扩大培养至菌液OD600约05-0.8。然后加入IPTG至终浓度为1mmol/L,进行诱导培养,5h后结束诱导(诱导剂浓度、诱导时间可视具体情况而定);
  • 收集沉淀:将诱导后的菌液在4℃条件下8000r/min离心15min,收集沉淀。加入0.01mol/L pH7.2的PBS洗涤离心后,再收集沉淀;
  • 重悬蛋白:将沉淀反复快速冻融3-4次,用PH8.0的 Buffer A重悬。然后冰浴中超声波破碎至溶液不再粘稠后,混匀静置10min,4℃条件下8000r/min离心10min,收集上清备用。

GST融合蛋白的纯化步骤

① 细胞裂解物与50 %谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合,室温轻摇使其吸附蛋白30min;

② 4℃,2100r/min条件下离心5min,弃上清,取样进行SDS-PAGE;

③ 沉淀中加入10倍标准体积的PBS后,颠倒混匀,洗去未结合的蛋白;

④ 4℃,2100r/min条件下离心5min,弃上清,取样进行SDS-PAGE;

⑤ 重复步骤③、④至少2次;

⑥ 将蛋白置于-20℃保存或用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱GST融合蛋白。

洗脱步骤如下:

  • 沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液,室温轻轻搅动10min;
  • 4℃,2100r/min离心5min,取上清;
  • 重复以上两步骤2次,合并3次的上清。

蛋白浓度的测定

用紫外分光光度计测定纯化蛋白样品在260nm和280nm波长的光吸收值,按照下式计算样品中蛋白质含量。计算公式:蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45×A280-0.74×A260)×稀释倍数。

GST蛋白纯化常见问题及建议

目的蛋白结合效率低或不结合

  • 裂解方式:过分的裂解会使标签蛋白变性,阻止其结合
  • 建议:在裂解过程中调节合适的超声功率和间隔时间或采用温和的机械/化学裂解方法。

  • 缓冲液条件:谷胱甘肽-琼脂糖树脂在pH值低于6.5或高于8.0时,结合效率会降低
  • 建议:使用前需用pH为6.5~8.0的PBS进行平衡。

  • 蛋白发生变性或聚集
  • 建议:使用前需用pH为6.5~8.0的PBS进行平衡。

    建议:可在裂解前加入1-10mM的DTT,在缓冲液中也加入DTT;蛋白-核酸结合或蛋白-蛋白结合可加氯化钠。

  • 蛋白或脂类在介质中聚集
  • 建议:及时清洗介质或更换新的介质。

  • 上样过程:上样量过载与上样流速过高均会影响GST标签蛋白的结合
  • 建议:在上样过程中要注意控制上样量与保持低流速。

  • GST 融合蛋白发生聚集沉淀
  • 建议:在裂解Buffer和其他缓冲体系中加入DTT

  • GST融合蛋白被过度稀释
  • 建议:重新浓缩样品,增加蛋白浓度。

目的蛋白洗脱不下来或洗脱率低

  • 洗脱条件
  • 建议:可以通过加大洗脱液体积、降低流速以及延长洗脱液的保留时间等措施提高洗脱效率。

  • 样品没有经过前处理
  • 建议:样品上柱前必须要经过离心或过滤。

  • 非特异性吸附
  • 建议:适当选择添加剂降低非特异性吸附。

  • 洗脱缓冲液中谷胱甘肽被氧化
  • 建议:洗脱缓冲液需现配现用,另外可以尝试加入1-5mM的DTT。

洗脱蛋白有杂质

  • GST融合蛋白被蛋白酶部分降解
  • 建议:加入蛋白酶抑制剂PMSF。注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

  • GST融合蛋白被蛋白酶部分降解
  • 建议:使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT,或ompT和lon双缺陷型菌株。

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