His标签是由6至10个组氨酸残基组成的一种表位标签,很容易被标签特异性抗体识别。His标签是蛋白纯化和检测的常用标签之一,由于其分子量小(只有0.84KD),融合到重组蛋白后,不会影响标记蛋白质的结构和生化特性。His抗体可以用于检测和His标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测His融合表达蛋白等,应用十分广泛。

His标签蛋白纯化原理

His标签蛋白纯化通常采用固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化的方法,主要利用介质配体螯合的金属离子吸附纯化表面带组氨酸残基的蛋白。由于His标签可与多种金属离子(如 Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe2+等)发生特殊的相互作用,所以可利用蛋白质表面的特性,使之被吸附在凝胶柱上,从而达到分离纯化蛋白的目的。组氨酸的残基上带有1个咪唑基团,可与Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性结合在金属离子上,这些金属离子能够用螯合配体固定在层析介质上,因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性结合在介质上,而其他杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱,从而得到纯度较高的His标签蛋白。

Ni2+、Co2+和Cu2+是His标签蛋白纯化中使用较为广泛的金属离子,因为它们在水溶液中与组氨酸具有较好的亲和性。其中,Ni2+是亲和纯化实验中最常使用的,根据结合基团不同,Ni2+亲和层析柱可分为两类:一类是Ni-IDA,另一类是Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位,其中Ni-NTA螯合了四价,Ni-IDA螯合了三价。所以,IDA的载量要比NTA高,在同样条件下,Ni-IDA洗脱时所需的咪唑浓度要高于Ni-NTA,但其弱结合能力使金属离子在洗脱时容易浸出,与目的蛋白紧密结合,从而导致分离蛋白产量偏低,产品不纯及金属离子污染等问题。NTA的颗粒粒度均匀,粒径更小,并且螯合镍更稳定,能耐受较高的还原剂,使填料更加稳定,镍离子不易脱落,所以实际实验中往往选择Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化。

His标签蛋白纯化步骤

菌体制备

  1. 取2支15ml的试管,每管加入10ml LB培养基、10μl菌种和10μl相应的抗生素,放入37℃恒温振荡培养箱180rpm过夜培养16h。
  2. 取800μl上述菌液加入800ml培养基,再加入800μl相应抗生素,放入37℃恒温振荡培养箱180r/min培养4h,使培养液OD600达到0.6~0.8。
  3. 加入800μl IPTG诱导剂,于37℃恒温振荡培养箱中继续培养4h。

菌体破碎

  1. 收集培养的菌液,8000r/min 4℃离心10min,收集管底的菌体。
  2. 根据实验需要取适量菌体加入10ml PBS缓冲液,涡旋振荡。
  3. 把混合菌体置于冰水浴中,用超声仪进行破碎。将超声仪器的超声探头伸入菌液中,注意不触及管底和管壁,每次超声破碎20s,总共四次,中间间隔半分钟(破碎时间、破碎次数和间隔时间可视具体情况而定)。
  4. 破碎后的菌液会显得比较澄清,此时将菌液于4℃离心机中8000r/min离心10min,离心时间也可延长。
  5. 离心后分离上清和沉淀,分别留样,通过SDS-PAGE电泳检测目的条带在上清中还是沉淀中。

蛋白纯化

  1. 菌液破碎离心后的上清液中加入2M咪唑溶液使终浓度为20mM,样品总体积为10ml。
  2. 过柱子的样品最好过0.45μm的滤膜,避免堵柱。
  3. 可溶性蛋白纯化
  4. (1) 平衡缓冲液:PH7.4的50mM磷酸缓冲液0.5M NaCl,含20mM咪唑。

    (2) 洗脱缓冲液:PH7.4的50mM磷酸缓冲液0.5M NaCl,含500mM咪唑。

    (3) 取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱,用10ml平衡缓冲液平衡,然后取破碎后的上清液10ml以0.5ml/min上样,然后以2ml/管,分管收集。

    (4) 用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集。

    (5) 用5ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集。

    (6) 再用5ml平衡缓冲液平衡柱子,灌满20%乙醇,封闭,以备下次使用。

    (7) 此方法是通用方法,若效果不佳,可用50 mM,100 mM,300 mM,500 mM分段洗脱,洗脱5-10个柱体积左右,1-2ml/min,2ml/管收集。

    (8) 将收集的各浓度梯度洗脱下来的蛋白,取样,进行SDS-PAGE。

    (9) 根据SDS-PAGE电泳图,若有蛋白,则收集蛋白进行透析,若上清无条带而沉淀中有条带,则用变性条件下沉淀,做沉淀纯化。

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