噬菌体展示技术是一种利用噬菌体表达外源基因的一项技术。主要以改构的噬菌体为载体,将外源蛋白分子或多肽的基因序列定向插入到噬菌体外壳蛋白质基因组中,使外源蛋白分子或多肽与噬菌体外膜蛋白融合表达,并展示于噬菌体颗粒的表面。这样外源蛋白或多肽的基因型与表型同时在同一噬菌体颗粒内,通过表型筛选就能获得它的编码基因。

噬菌体表面展示系统

目前已有多种外壳蛋白被用于噬菌体展示,本文将主要介绍单链丝状噬菌体、T4噬菌体以及λ噬菌体等几种常见的噬菌体展示系统。

1. 单链丝状噬菌体展示系统

主要用于抗体分子展示的是PⅢ蛋白和PVⅢ蛋白。其中PⅢ蛋白位于噬菌体颗粒的尾端,含有406个氨基酸残基,由3个结构域组成。3个结构域由甘氨酸富集的连接肽串联起来,使得在结构上具有高度易变性和灵活性,因此在N端可以插入较大的外源片段,既不会影响噬菌体的结构和功能,也可保持融合表达的外源片段相对独立的结构构象。

而PVⅢ蛋白作为噬菌体的主要外壳蛋白,含有32个氨基酸残基,其C端与噬菌体DNA结合,构成噬菌体包膜的内壁,N端游离在外,可容纳较小的外源片段。

2. T4噬菌体展示系统

T4噬菌体与丝状噬菌体不同,其病毒颗粒是在宿主细胞内组装,不需要通过分泌途径,因而其表面展示多肽和蛋白的范围广,尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质。

目前应用较多的是小外衣壳蛋白展示系统。小外衣壳蛋白分子量约为9KD,为T4噬菌体组装必需组分,具有与成熟衣壳表面特定位点专一结合的能力。现已成功利用该系统表达了脊髓灰质炎病毒VP1衣壳蛋白和HIV-1病毒被膜糖蛋白gp120的V3环状结构域,产物均可形成正确的空间结构,具有较好的生物活性。

3. λ噬菌体展示系统

λ噬菌体展示系统是将外源序列插入噬菌体主要尾部蛋白PVC端折叠区(非功能区),或是噬菌体头部组装必需的D蛋白N端或C端,从而实现外源蛋白的表面展示。

λ噬菌体是在宿主细胞内完成装配,无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜,可展示有活性的大分子蛋白(100KD以上蛋白)及对宿主细胞有毒性的蛋白,适用范围极广。

4. D蛋白展示系统

D蛋白的分子质量为11 ku,参与野生型λ噬菌体头部的装配。D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,因此D蛋白可作为外源序列融合的载体。

病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外,体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面,而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中,从而补偿溶源菌所缺的D蛋白,通过热诱导而组装。

噬菌体展示技术局限性

  • 在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装,有的展示系统还要经过跨膜分泌过程,大大限制了所建库的容量和分子多样性;
  • 不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达,有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合,导致在体内筛选时需外加选择压力。例如,在噬菌体展示文库试验中,由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解,因此,必须小心控制条件,以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解;
  • 噬菌体展示文库一旦建成,很难再进行有效的体外突变和重组,进而限制了文库中分子遗传的多样性;
  • 由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达,所以,一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子,很难得到有效表达和展示。

参考文献

【1】蔡尽忠等.噬菌体抗体库技术概述.【J】生物学教学 2017年第5期

【2】王长军等.噬菌体表面展示技术进展.【J】国外医学免疫学分册 2001第4期

【3】王志文等.噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展.【J】蚌埠医学院学报 2015第1期

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