表观遗传(Epigenetics)是指在核酸(DNA)序列不发生改变的情况下,基因的表达、调控和性状发生可遗传的改变(根本原因是表观遗传修饰的不同),即在未改变基因型的前提下改变表型。利用表观遗传学可用于研究某一组织生理病理变化。结合单细胞测序技术,可用于研究肿瘤疾病的发病机制、早期诊断、晚期控制等。

表观组学测序(Epigenomics Sequencing)是以高通量测序平台为基础,研究基因表达及调控的可遗传变化的技术。根据研究内容可将表观组学分为两类:DNA/RNA的化学修饰和DNA/RNA与蛋白质相互作用。常用的表观遗传学测序方法包括BS-seq和ChIP-seq。

BS-seq

DNA甲基化是重要的表观遗传学标记信息,获得基因组范围内所有C位点的甲基化水平数据,对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。目前已经建立了至少三种DNA甲基化分析技术。包括甲基化DNA免疫共沉淀测序(methylated DNA immunoprecipitation sequencing,MeDIP-Seq)、甲基结合蛋白测序(methyl-binding protein sequencing,MBD-Seq)和重亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing,BS-seq),其中MeDIP-Seq和MBD-Seq都是基于富集的原理,而BS-seq不经过富集可以直接进行测序。

BS-seq是将bisulfite处理与高通量测序相结合,从而检测基因组DNA分子中每一个甲基化位点的状态。

原理

以bisulfite处理基因组DNA,发生甲基化的C碱基无变化,而未发生甲基化的C碱基会脱氨变成U,针对改变后的DNA序列设计特异性引物,并进行PCR扩增。PCR产物中原先未发生甲基化的C变成T,从而可以与发生甲基化修饰的C碱基区分。PCR产物克隆后进行高通量测序。与参考序列比对,即可得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。

优点

  • 高分辨率:能够精确检测每一个甲基化位点的状态。
  • 高覆盖度:在全基因组范围内定量分析甲基化位点,精确绘制DNA甲基化图谱。
  • bisulfite的转化效率达99%以上。

缺点

  • 耗时耗力,且通量有限。
  • 需要提前设计引物,而这一步骤容易导致bias(例如,引物末与尾端结合而结合到需进行扩增和测序的片段内)。

应用

  1. 研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联。
  2. 研究环境、营养以及其他因素对特定基因甲基化的影响。
  3. 为人类疾病的发生、治疗以及动植物分子育种等提供研究基础。

ChIP-seq

染色质免疫共沉淀测序(chromatin immune precipitation,ChIP-seq)是一种基于ChIP实验与高通量测序技术、被用于分析细胞内蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法,通俗的来讲就是将ChIP实验得到的DNA进行测序再进行下游分析。能够高效地在全基因组范围内研究目的蛋白的结合位点、组蛋白修饰及核小体定位情况。

原理

通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,然后对这些DNA片段进行进行高通量测序,最后定位基因组信息,从而获得全基因组范围内组蛋白DNA及染色质修饰等DNA区段信息。

测序流程

  1. 通过甲醛使靶蛋白与染色质上目标区域的DNA交联结合,分离染色体,并用超声或酶处理将其打断成小片段(一般200-600bp)。
  2. 添加与目标蛋白质特异的抗体,利用抗原抗体反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来(抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体)。比对原始序列到参考基因
  3. 原始序列分布
  4. 通过解交联释放染色质上目标区域的DNA片段,以达到纯化DNA的目的,通过PCR(qPCR)检测目标区域的DNA是否被靶蛋白富集到,即可进行高通量测序。
  5. 最后将这些DNA片段比对到对应的参考基因组上。

优点

  • 分辨率高,可精确到10~30bp。
  • 能实现真正的全基因组分析。
  • 所需样本量小。
  • 避免了杂交等影响因素,具有更高的敏感性等。

缺点

  • 成本较高。
  • 数据的质量依赖于抗体的质量。

应用

  1. 用于组蛋白修饰、特定转录子调控作用等表观遗传学的研究。
  2. 解决细胞分化,染色质动态图谱、疾病发生发展等生物学问题。
  3. 对基因调控机制及基因调控网络进行更深入的研究。
  4. 对疾病病理机制的研究深入至基因异常表达的源头。