Smart-seq

Smart-seq技术是由美国和瑞典科学家共同开发的一种单细胞转录组测序技术，其能够检测mRNA的全长。

测序原理

用莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶（moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase，MMLVRT）逆转录全部RNA，然后加入PCR引物，进行常规PCR扩增，再进一步将扩增的cDNA打断，用于构建标准的Illumina测序文库。

Smart-seq关键技术

  • CDS引物：（5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN3’，V代表A、C或G，N代表A、T、C或G）：两个末端核苷酸将引物锚定在poly(A)尾巴的开始处，这样就保证了逆转录的起始位置正好是mRNA的3’端的序列终止位置。
  • 引物2：由一段通用序列及它的3’端是3个非脱氧的G碱基构成（RNA的G碱基），这个引物可以与新合成的cDNA的3’端的几个C碱基互补杂交。
  • MMLVRT：同时具有模板转换和末端转移酶的活性，其在转录到mRNA的5’端末端的时候，会在新合成的cDNA的3’末端，多出几个C碱基。

Smart-seq测序流程

  1. 分离获得单个细胞，并将单个细胞转移至低渗裂解缓冲溶液（裂解液中含有RNase抑制剂）中进行裂解，转录组释放于裂解液中。
  2. 加入MMLV逆转录酶、dNTP、oligo(dT)VN Primer、MgCl2等，对mRNAs进行反转录，获得cDNA第一条链，同时由于MMLVRT的末端转移酶活性会向cDNA的5’末端加上非模板化的胞嘧啶（C）残基。
  3. 引物2对所加的C碱基进行互补配对，然后引导MMLVRT再次发挥聚合作用，得到双链cDNA。
  4. cDNA合成之后，进行12-18个循环的cDNA PCR扩增（100 pg的总RNA，需要15个循环，对于10 pg的总RNA，可以进行18个循环），将扩增的cDNA用于构建标准的Illumina测序文库。

优点

  1. 完整阅读mRNA5’端。
  2. 可用于筛选SNPs。
  3. 不需要知道mRNA的序列。
  4. 使用低于50pg的起始材料。
  5. 高水平的可定位序列。
  6. 突出优点是可以筛选单核苷酸多态性（SNPs）和变异体。

缺点

  1. 不稳定，低水平表达的转录组可能丢失。
  2. 转录本长度偏向性，对超过4Kb的序列不能高效转录。
  3. 并非链特异的。
  4. 价格较高。

Smart-seq2

Smart-seq2是经Smart-seq改进的一种测序方法，也目前最常用的单细胞转录组技术之一。

测序原理

通过设计oligo(dT)VN Primer作为逆转录引物，利用MMLVRT的模板转换活性，在cDNA的3’端添加一段接头序列，通过该接头序列进行反转录，生成cDNA第一条链。当逆转录酶到达mRNA5’末端时，会连续在末端添加几个胞嘧啶（C）残基。然后添加TSO引物，退火后结合在第一条链的3’端与poly(C)突出杂交，合成第二条链。这样得到的cDNA经过PCR扩增，获得纳克级的DNA，纯化后可用于测序。

Smart-seq2关键技术

甜菜碱（N，N，N三甲基甘氨酸）是一种高效的甲基供体。在反转录体系中加入甜菜碱，其能够增加转录所需酶（蛋白质）的热稳定性，并通过破坏DNA螺旋的稳定性降低碱基对DNA热融化转变的依赖性。此外，甜菜碱还可以使cDNA的形成更加完整。一些RNA有着例如发夹结构、环形结构等二级结构，影响逆转录酶与其结合，加入甜菜碱可解决这一问题，最终得到完整的cDNA文库。此外，在加入甜菜碱的同时增加Mg2+的浓度也可在一定程度上提高cDNA产量。

TSO引物序列（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3’）：在5’端带有1个通用引物序列，而在3’末端，有两个核糖鸟苷（rG）和一个锁核苷酸（Locked Nucleic Acid，LNA）修饰的鸟苷（G），可以促进模板转换，进而扩增出完整的cDNA序列。

Smart-seq2测序流程

  1. 分离出单细胞，并用裂解液裂解细胞。
  2. 在裂解液中加入MMLV逆转录酶、游离的dNTPs、oligo(dT)VN Primer、甜菜碱、MgCl2等，通过oligo(dT)VN Primer启动mRNAs反转录，获得cDNA第一条链。
  3. RT反应通常在42°C进行90分钟，但是某些RNA形成二级结构（例如发夹或环），由于空间位阻，可能导致酶终止链延长。通过添加海藻糖和甜菜碱，可以在某种程度上克服这种不良影响。
  4. 当反转录到达RNA5’末端后，MMLV逆转录酶的末端转换活性会在cDNA末端加非模板编码的核苷酸，通常是dCTP。
  5. 加入模板转换引物TSO，当反转录到达mRNA的5’末端，TSO3’的r（G）3和cDNA序列中富含dC的序列依靠互补作用促进模板转换。MMLV反转录酶会转录这个寡核苷酸序列，进行后续PCR扩增，获得双链cDNA。
  6. cDNA合成之后，加入常规PCR引物，进行常规PCR扩增，将扩增的cDNA打断，构建标准的Illumina测序文库。

优点

能够得到全长cDNA。用于分析可变剪切等。

缺点

只分析带Poly（A）的RNA。

Smart-seq与Smart-seq2的区别

  • Smart-seq2与Smart-seq相比，使用了锁核酸（locked nucleic acid，LNA）、更高浓度的MgCl2以及甜菜碱。
  • Smart-seq2不需要纯化步骤，比Smart-seq产量更高。
  • Smart-seq2只能对具有polt-(A)尾巴的mRNA进行扩增和检测。

参考文献

[1] Picelli S , Faridani O R , Bj?Rklund ? K , et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature Protocols, 2014, 9(1):171-181.

[2] Wang Y , Navin N . Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):598-609.