包涵体是外源基因在原核细胞中表达时所形成的不溶性蛋白质颗粒。包涵体蛋白不具有生物活性,所以给需要制备活性蛋白来开展下游实验的科研工作者们带来了诸多不便。那么,如何进行包涵体蛋白制备,如何对包涵体进行复性和纯化,以获得有活性的可溶性蛋白呢,请看下文具体介绍。

包涵体蛋白制备

1.包涵体裂解

实验人员的蛋白通常来自细菌、哺乳动物细胞和植物细胞等,需要根据蛋白的来源
和性质不同选择合适的裂解方法。常见的包涵体蛋白裂解方法有:超声破碎法、溶
菌酶处理法、细胞匀浆法、反复冻融法等,前两种方法相对来说更常用一些。超声
破碎步骤可参考His标签蛋白纯化,但在超声之前一般要向溶液中加入1% Triton X-100。

2.包涵体洗涤

包涵体在裂解之后需要进行洗涤,因为包涵体中除了含有重组蛋白,还含有RNA
聚合酶、外膜蛋白等杂质蛋白以及DNA、RNA核酸片段和多糖等。通过洗涤可以
除去一些影响重组蛋白活性的杂质。我们可以使用低浓度的变性剂,如2M尿素在
50mM Tris(pH7.0-8.5),1mM EDTA中洗涤。或者也可以使用一些温和的去垢
剂如Triton X-100、CTAB等,而去垢剂的洗涤能力会随溶液中离子浓度的升高而
增加,所以可向溶液中加入较高浓度NaCl。

3.包涵体溶解

包涵体蛋白一般只溶于强的变性剂如尿素(浓度6~8mol/L)和盐酸胍(浓度5~7 mol/L),它是通过打断离子间的相互作用进而打断包涵体蛋白分子内和分子间的各种化学键,从而使多肽能够正常伸展。

4.包涵体复性

由于包涵体中重组蛋白的高级结构被破坏,失去生物活性,所以需要采取恰当的复性方式使蛋白能够正确折叠。蛋白的复性可以说是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。由于不同蛋白的性质存在差异及所处环境不一,其复性条件也就大不相同。通常一个蛋白都会有一个最佳的复性条件,只有选择到了合适的复性缓冲液,使蛋白能够正确折叠,才有利于进一步的分离纯化。

常用的蛋白复性方法:

复性方法 方法介绍 优点 缺点
稀释复性 直接加入水或复性缓冲液以降低变性剂浓度从而使蛋白能够重新折叠 操作简单 易沉淀;速度不易控制;体积大增加较大,后续处理困难
透析复性 通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度 控制折叠,缓慢进行;不增加体积 易沉淀;不适合大规模操作;周期长
超滤复性 选择合适载留分子量的膜,允许变性剂通过膜而蛋白质无法通过 生产中使用较多,规模较大;易于对透析速度进行控制 不适合样品量较少的情况;有些蛋白在超滤过程中发生不可逆的变性
柱上复性 通过将目标蛋白结合到层析柱上,减少蛋白分子间的相互影响,常用于复性的层析方法有SEC、HIC、亲和层析等 复性回收率高;快速、易放大;样品稀释倍数小

5.包涵体纯化

包涵体复性以后可以采取与可溶性蛋白相似的方法,包括金属亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,详情见包涵体纯化方法介绍