抗体亲和力表示抗体与抗原结合能力的大小。在体液免疫中,再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答,这种现象称为抗体亲和力成熟(antibody affinity maturation)。通过抗体发现技术获得的抗体具有良好的结合特异性,但亲和力欠佳,尤其是通过天然抗体库筛选的抗体,没有经过抗原诱导的免疫进化,导致其亲和力较低,极大的限制了抗体的临床应用。因此就需要抗体亲和力体外成熟技术提高抗体亲和力。

抗体体外亲和力成熟技术主要是模拟体内亲和力成熟过程,采取各种策略对抗体基因进行相应突变,构建突变抗体库,通过亲和筛选获得高亲和力抗体。选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题,目前突变策略主要以随机突变、置换和定点突变三大类为主,基于结构实现抗体亲和力提升的技术也在不断开发中。

抗体亲和力成熟服务

  1. 设计突变
    • 随机突变:易错PCR(error-prone PCR)& DNA-shuffling
    • 定点突变:抗体可变区FV结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计
  2. 筛选和亲和力测定
  3. 利用噬菌体展示或细胞展示技术,构建抗体突变库,筛选出高亲和力抗体,利用SPR/BLI技术测定抗原-抗体亲和力,并对抗体进行测序。

客户提供 服务流程 交付内容 周期
VH/VL序列
/单克隆杂交细胞株
  • 抗体测序、序列分析及结构生物学分析
  • 计算机辅助抗体设计
  • 噬菌体展示和筛选
  • 抗体生产和亲和力测定
  • 抗体序列,序列分析报告
  • 抗体鉴定报告及数据
约20周

抗体亲和力成熟技术

随机突变

采用随机突变编码可变区的基因片段的方法一般又有易错PCR法(error-prone PCR)、DNA改组法(DNA shuffling)和链置换法(chain shuffling)等。

  • 易错PCR:错配PCR法通过改变PCR的条件,使目的基因片段在复制的过程中碱基对发生错误的配对,从而引入突变。
  • DNA改组法:DNA改组法同样运用随机突变的原理,在获得较大容量的功能蛋白质突变体库的基础上,结合运用相应的快速富集筛选方法(主要是以噬菌体表面展示为主的各种表面展示技术)对突变体进行筛选,最终得到进化的功能蛋白质分子。
  • 链置换法:链置换则依据抗体可变区随机配对的原理,保留某个特定抗体的重链或轻链,并与一个随机化的互补链进行组合,从中筛选更高活性的突变株。

由于通常认为抗体的重链CDR3区对抗体的结合能力至关重要,因此轻链的替换较为常见。例如,已知某一抗体具有某种抗原亲和活性,将其一条链(轻链)不变,提供对特定抗原的特异性,将二者随机组合,构建次级抗体库,从中筛选理想的另一条链(重链)与其搭配,这样就增加了抗体的多样性和高亲和力抗体筛选的机会,重复进行链替换和亲和力筛选将产生高亲和力的抗体。不过,这项技术的缺点也很明显:必须对抗原有比较明确的认识,而且要在一个比较完善的初级抗体库或抗体的基础上才能采用此项技术。

定点突变

采用定点突变方法的前提是需要对基因及表达的蛋白产物的三维结构和功能等方面的信息有着较为透彻的了解。抗体的互补决定区集中在一起形成一个特定的三维结构,其中包含了一个和抗原结合的部位,同时互补决定区突变的频率也最为频繁。借助计算机模拟技术,通过同源模建技术获取抗体模型并分析抗原抗体结合活性位点,探究抗原与抗体结合过程中的构象及能态的变化,可以针对性地对抗体的氨基酸序列进行修改以提高抗体亲和力。

由于天然抗体在亲和力成熟过程中,体细胞高频突变发生区域并非均匀分布,而是主要集中在与抗原直接接触的CDR区。这样既可以获得足够的序列多样性,又不会破坏蛋白质结构。因此在抗体的亲和力体外成熟中,CDR区是最常选用的定点突变区域。